内容摘要：钾离子(K+)是人体中最丰富的细胞内金属，在调节细胞内液量，营养运输以及通过神经和肌肉收缩的细胞间通讯中起着至关重要的作用。另一方面，K+动态平衡的异常改变导致多种疾病，涉及心血管和神经系统疾病，糖尿

钾离子(K+)是加州人体中最丰富的细胞内金属，在调节细胞内液量，大学营养运输以及通过神经和肌肉收缩的伯克细胞间通讯中起着至关重要的作用。另一方面，利分离比例荧K+动态平衡的校活细胞像异常改变导致多种疾病，涉及心血管和神经系统疾病，中钾糖尿病，光成光传感器肾脏疾病和癌症。双荧由于细胞内和细胞外K+浓度之间的加州巨大差异（[K+]内= 150 mM，[K+]额外= 3-5 mM），大学对K+生理学和病理学的伯克研究尚未得到满足。相对缺乏可靠地测量生物样本中细胞内K+动态变化的利分离比例荧方法，这些方法满足了对K+的校活细胞像低亲和力和高选择性的双重挑战，尤其是中钾对钠离子(Na+)而言，目前可用的光成光传感器荧光K+传感器在很大程度上通过高亲和力受体进行了优化。更适合细胞外K+检测。

最近，加州大学伯利克分校Christopher J. Chang教授团队报告比例钾离子传感器1（RPS-1）的设计，合成和生物学评估，该传感器是一种双荧光团传感器，能够对活细胞内钾离子进行比例荧光成像。相关论文A dual-fluorophore sensor approach for ratiometric fluorescence imaging of potassium in living cells发表在《Chemical Science》上。RPS-1通过钾键将对钾离子具有低亲和力，高选择性冠醚受体的钾敏感荧光传感器片段（PS525）与钾不敏感的参比荧光团（香豆素343，Coumarin 343）通过酯键相连。在细胞内递送后，酯酶定向的裂解将这两种染料分裂成单独的片段，从而可以按比例检测K+。RPS-1对水性缓冲液中的K+有反应，对竞争性金属离子具有高选择性，并且在稳态细胞内水平对钾离子敏感，并且可以对从该基础设定点开始的减少或增加做出反应。此外，RPS-1被用于比较筛选一组不同癌细胞系中的K+库，揭示了转移性乳腺癌细胞系相对于正常乳腺癌细胞的基础细胞内K+升高。这项工作为研究细胞内钾动力学提供了独特的化学工具，并且是基于不依赖FRET或相关能量转移设计的双荧光团方法设计其他比例荧光传感器的起点。

为了开发一种适合细胞内使用的钾比例计量传感平台。原则上，钾敏感部分应具有低亲和力受体，以更好地匹配150 mM范围内的高水平静息细胞内K+池并通过基于强度的开启响应做出响应，而钾不敏感染料则应钾传感器显示出独特的光谱激发和发射，用于内部校准。由于缺乏对K+的荧光响应，作者选择香豆素343作为内标荧光团，并针对传感器的其他部分设计和合成了新的钾敏感染料钾传感器525（PS525）（示意图1a）。香豆素343通过两个基于酯的接头与PS525偶联，得到RPS-1（示意图1b）。RPS-1传递到细胞后，细胞酯酶将裂解酯键，以1：1的比例提供两个单独的荧光团PS525（对K+敏感）和香豆素343（对K+不敏感）（示意图1c）。切割后，两个荧光团由于其带负电荷的羧酸根基团可被细胞捕获。这样，PS525和香豆素343的各自发射曲线的比率可以确定细胞内K+浓度的读数。

示意图1比例钾传感器1（RPS-1）的设计和作用。

由于RPS-1设计由与内部染料标准品相连的K+响应荧光部分组成，用于比例式校准，因此作者试图制备一种新的开启荧光传感器，该传感器在高细胞内[K+]范围内对K+有选择性地响应 150 mM。为了实现这一目标，选择了套索状醚修饰的氮杂-冠状醚受体作为K+响应部分，因为与cryptand和G-quadruplex部分相比，它对K+保留的Na+选择性高，但对K+的结合亲和力较弱（图 1b和2a）。

图2 PS525的开启响应和钾选择性。

示意图2中显示了K+反应性部分钾离子传感器525（PS525）的合成。套索醚改性的氮杂-冠醚1是使用已公开的方法合成的，然后在N，N-二甲基甲酰胺中使用磷酰氯，通过Vilsmeier-Haack反应，通过Vilsmeier-Haack反应转化为氧杂蒽2，然后以三氟乙酸为溶剂进行间苯二酚缩合。Rhodol 3的合成方法是将2上的羟基转化为三氟甲磺酸酯基，然后进行Buchwald-Hartwig胺化反应，添加叔丁氧羰基（Boc）保护的哌嗪基，并用痕量三氟乙酸处理。最后，通过使3与2-溴乙酸甲酯反应，然后在四氢呋喃和水的混合物中处理氢氧化锂，获得PS525。

示意图2 PS525的合成。

作者评估了PS525在缓冲至生理pH（50 mM HEPES，pH 7.4）的水溶液中的光学性质。PS525显示了在525 nm处的最大吸收峰，在存在K+的情况下，在0和200 mM的K+下，计算出的吸收系数分别为ε= 61 100 M-1 cm-1和ε= 65 000 M-1 cm-1（图5）。当暴露于K+时，PS525的荧光发射集中在552 nm处开启7倍（图2b），量子产率从不存在K+时的0.03增加到存在K+时的0.15（图2b）。根据Benesi–Hildebrand图K+滴定反应，探针的Kd值计算为137 mM，与150 mM范围内的细胞内[K+]匹配。

接下来，作者与一组生物学相关的碱金属，碱土金属和过渡金属相比，测试了PS525对K+的金属选择性（图2c）。值得注意的是，即使对K+的亲和力很低，PS525在相关的细胞内水平上对Na+的选择性也比对Na+高出五倍，这预示它对下游生物学应用具有足够的敏感性和选择性。然后，作者测试了PS525和香豆素343对细胞内K +浓度（140 mM）附近K+的比率响应的敏感性（图2d）。在80 mM至120 mM的范围内，进行线性回归分析以计算5.8 mM的检出限。另外，PS525和香豆素343的pH敏感性测试证明了它们在生理pH下的可用性。

在确定PS525是选择性和敏感的荧光K+敏感染料单元后，作者将2-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridine-3-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TATU) 作为碳酸盐激活剂，通过将PS525与先前报道的香豆素synthon63酯化来合成RPS-1。作者测试了RPS-1的荧光响应和酯酶催化的水解。然后，将RPS-1用于通过共聚焦显微镜对细胞内K+池进行比例荧光成像，并考虑到PS525传感单元能够选择性地对体外水性缓冲液中生物学相关浓度的K+水平做出反应。注意到，对K+不敏感的香豆素343的量子产率为0.02，与PS525部分相当，但在单独的458 nm波长处被激发。在成像之前，首先将HeLa细胞与10μMRPS-1孵育，以确保探针摄取和酯酶裂解。使用Coumarin 343单元的458 nm激发（蓝色通道）和PS525单元的514 nm（绿色通道）激发，获得了双色共焦显微镜图像。然后使用这两个通道（绿色通道/蓝色通道，图3b）获得比率图像。为了评估RPS-1是否可以通过其PS525单元响应细胞内K+的变化，然后用5μM缬霉素对HeLa细胞进行处理，这种化合物已知可以通过膜螯合和转运钾，并耗尽K+的细胞内池。在添加缬氨霉素后的0、5、15、30、45、60分钟拍摄了来自两个通道的共焦图像，并与媒介物对照进行了比较。与媒介物对照组相比，作者观察到了由缬氨霉素刺激的HeLa细胞中绿色/蓝色比率强度的明显降低（图3c）。

图3（a）RPS-1的合成和使用RPS-1的细胞内K+库的比例成像。（b）使用RPS-1的基于时间的比例荧光成像可以监测用5μM缬氨霉素处理1 h的活HeLa细胞中细胞内K+库的消耗。绿色通道显示在514 nm激发下来自PS525发色团的发射，蓝色通道显示在458 nm激发下来自香豆素 343发色团的发射。来自两个通道的荧光比图像由ImageJ构建。（c）通过ImageJ测量和分析绘制的多个生物学重复样本的平均荧光强度比。

参考文献：

http://doi.org/10.1039/D0SC03844J

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